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Inhibition de l’expression des gènes par l’ARN anti-sens :
Durant leurs recherches en biologie de synthèse, les scientifiques ont découvert l'existence d'un ARNi dit interférence ARN. L'ARNi est une molécule d'ARN double brin ou bicaténaire qui permet de bloquer l'expression des gènes, et donc de les rendre inactifs. En effet, cette molécule est impliquée dans le blocage de la transcription et de la traduction du gène.
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Le principe repose sur l'injection de plusieurs copies d'ARN double brin (dsARN) dans un organisme. Cette technique nécessite, au préalable, la production d’ARNi en laboratoire. Pour cela, on récupère de longs dsARN qui vont être découpés en plus petites structures par l'enzyme DICER. Ces fragments sont ainsi appelés siARN (short interfering RNA): ils sont constitués d'une vingtaine de nucléotides. La protéine RISC se fixe ensuite sur les fragments d'ARN dont elle va dégrader un des deux brins. Il reste alors seulement une courte séquence d'ARN simple brin, complémentaire du gène à inhiber : il s'agit de l'ARN anti-sens.
A partir de ce moment, on distingue deux modes d'actions:
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soit le fragment d'ARN, ARN anti-sens, se place sur l'ARNmessager en cours de traduction, bloquant ainsi l'action du ribosome (qui ne peut prendre en charge une double hélice d'ARN). La traduction est ainsi stoppée : le gène est inhibé.
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soit l'ARN anti-sens se place au niveau du brin d'ADN en cours de transcription, bloquant ainsi l'action de l'ARN polymérase. Le gène n'est pas transcrit, il est donc inhibé.
Afin d'aboutir à une cellule minimale, on va observer la cellule avec son gène inactif et voir si elle continue de se développer. Si c'est le cas, le gène n'était donc pas essentiel à son fonctionnement et il peut donc être sorti du génome.
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Mutagénèse massive par des transposons :
Le principe de cette technique repose sur l'insertion de transposons dans le génome d'une cellule. Un transposon est un morceau d'ADN double brin capable de s'intégrer dans un brin d'ADN, il possède entre 3000 et 6000 paires de bases. Une paire de bases est le couplage de deux bases nucléotidiques situées sur deux brins complémentaires d'ADN. Cette unité de mesure permet de déterminer la longueur d'une molécule d'ADN. Cette intégration se fait de manière aléatoire: le transposon va s'insérer où il veut dans le brin d'ADN. En s'intégrant, il va « casser » le gène, le rendre inactif. Les scientifiques ont remarqué qu'il y avait des zones où les transposons ne s'intégraient pas. Il s’agit de zones comportant les gènes essentiels au fonctionnement de la cellule. C'est par cette technique que Craig Venter et son équipe ont pu créer une cellule minimale possédant seulement 473 gènes.
Cette notion de cellule minimale a une approche top-down ( ), c'est à dire qu'on sort un à un des gènes jusqu'à obtenir un organisme possédant un petit génome et continuant de fonctionner malgré le manque de certains constituants (non vitaux).
On estime que le génome humain est composé de 20231 gènes soit environ 3,2 milliards de paires de bases (unité de longueur de l’ADN double brin).
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Inactivation systématique des gènes :
L'inactivation systématique des gènes est une technique appliquée en particulier aux cellules humaines.
Afin de réaliser l'inactivation d'un gène, il faut au préalable identifier le gène. Il faut aussi connaître la séquence de nucléotides précédant et suivant le fragment d'ADN choisi (le gène). Ce fragment est par la suite cloné, c'est à dire, que l'on va l'isoler et le conserver en gardant l'intégralité de la séquence nucléotidique.
Le principe de cette technique est basé sur la recombinaison homologue, soit l'échange de fragments d'ADN entre des molécules double brins ayant des séquences identiques. Ici, on a donc la possibilité de remplacer un gène complet par une version de lui-même qui sera incomplète, cela aura pour conséquence l'inexpression du gène. Il est aussi possible d'insérer un autre gène à la place du gène choisi précédemment.
Une fois le clone de gène obtenu, celui-ci va être placé par électroporation dans une cellule souche embryonnaire, une cellule ES. L'électroporation est une technique permettant d'introduire de l'ADN dans une cellule en augmentant la perméabilité de la membrane par un courant électrique. On fait le choix de la cellule ES car celle-ci peut se répliquer indéfiniment et se différencier en plus de 200 types de cellules différentes, c'est une cellule pluripotente ( ).
Par la suite, un long travail est réalisé afin de sélectionner un clone d'une cellule ES ayant effectivement le gène transformé et ayant aussi réaliser la recombinaison homologue. Ainsi si une cellule se développe, c'est que le gène n'était pas essentiel à son fonctionnement et inversement si la cellule meurt. On appelle cette technique un knock-out.
Cellule pluripotente = cellules souches pouvant se différencier en n'importe quel type de cellules de l'organisme
Outils utilisés pour l'élaboration d'une cellule synthétique :
Détermination des gènes non-essentiels
Dans la partie précédente, vous avez pu découvrir qu'il existe différentes approches pouvant aboutir à la synthèse d'une cellule minimale : Bottom-Up et Top-Down. Cependant, dans la pratique on ne sait pas encore réaliser des cellules minimales entièrement synthétiques dans lesquelles on insérerait la totalité des gènes essentiels (Bottom-Up). C'est pourquoi il vous est présenté, dans cette partie, différents outils permettant de réaliser la stratégie Top-Down.
